今天给大家分享一篇网药的文章，都说网药不好发，只能说是你的思路不够好。看看这篇文章，内容丰富程度以及逻辑的清晰度令人佩服，不仅用上了网药、多组学，还结合了NHANES的临床数据

健骨颗粒通过纠正骨稳态失衡改善绝经后骨质疏松症:基于多组学验证的网络药理学分析

研究背景

绝经后骨质疏松症（PMOP）是老年女性雌激素缺乏介导的骨稳态失调的一系列反应。健骨颗粒是一种中药配方，已被证明是治疗PMOP的有效方法，但其复杂的调节机制仍需要更多的研究。

研究思路

利用NHANES数据库对正常人群与PMOP患者的临床信息进行比较。整合转录组学和蛋白质组学数据，识别了与PMOP相关的基因，并用生物信息学方法和预后模型进行深入分析。网络药理学分析用于确定健骨颗粒在PMOP中的作用靶点。此外，我们还通过大鼠模型实验验证了健骨颗粒的安全性和有效性。

数据来源

GSE56815(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE56815)，包含来自绝经前和绝经后女性低血压的循环单核细胞的转录组数据和临床信息。或高骨质量密度（BMD），是从基因表达综合（GEO）数据库中获得的。此外，对来自Sham、OVX和JG7ml/kg/d组的大鼠腰椎（L3、L4）的三个组织样本进行了蛋白质组分析。具体的实验方法已在之前的出版物中阐述。质谱蛋白质组学数据已通过PRIDE合作伙伴存储库存入Proteome Xchange联盟，数据集标识符为PXD037316。 

结果

△图1：总离子色谱指纹图谱

为了确定健骨颗粒治疗PMOP的最佳剂量，作者采用HE染色、番红O/固绿染色和Masson染色进行分析。结果显示，与PMOP模型组（NC）相比，JG（7mg/kg/d）和JG（14mg/kg/d）组的骨小梁分布显著增加，但与假手术组（Sham）和对照组（E）相比没有显著差异（图2A）。定量分析显示，JG（7mg/kg/d）、JG（14mg/kg/d）和E组之间的治疗效果差异无显著性（图2B）。因此，我们选择7mg/kg/d作为后续实验中健骨颗粒的最佳治疗剂量和标准日常治疗剂量。进一步的血清分析评估了健骨颗粒对SD大鼠的肝肾毒性，结果显示各组大鼠的ALT、AST、TB、BUN和Cr水平差异无统计学意义（p>0.05）。这些结果表明，使用健骨颗粒JG（7mg/kg/d）或JG（14mg/kg/d）剂量治疗PMOP在动物实验中是安全的，对肝肾功能没有显著影响。

△图2：健骨颗粒的剂量选择及毒理学分析结果

为了评估健骨颗粒在治疗PMOP中的效果，我们通过qPCR和Western blot分析了CoLLa1、骨钙素（OST）、Osterix（OSX）和RunX2的表达水平。Western blot结果显示，与Sham组相比，OVX组中这些蛋白的表达水平显著降低，而经过健骨颗粒处理后，这些蛋白的表达恢复至接近正常水平（图3A, B）。qPCR分析也证实了mRNA表达的变化，显示了类似的趋势（图3E）。具体而言，OVX组中COLLA1、OSX和RunX2的mRNA水平低于Sham组，而健骨颗粒干预后，这些基因的相对表达量显著高于OVX组。股骨Micro-CT扫描结果显示，Sham组和JG组的骨小梁分布均匀，排列规则且呈网格状（图3C）。进一步分析表明，JG组的骨密度（BMD）和骨体积/组织体积分数均高于OVX组，同时骨小梁间距显著低于OVX组（图3D）。这些结果为健骨颗粒在治疗PMOP中的优越疗效提供了有力证据。

△图3：健骨颗粒对治疗绝经后骨质疏松症有效

为了探索骨密度正常个体和PMOP个体之间的差异，从NHANS数据库中获得了2005—2018年3023名绝经后女性的健康信息，基线数据见表2。通过进行单变量分析，确定了几个有意义的变量，包括单核细胞比例，年龄，种族和酒精摄入量在PMOP组和正常组(稳定1)之间。其中，单核细胞在PMOP组中显著增加。此外，采用多变量logistic回归分析，我们发现PMOP组的单核细胞比例显著高于正常组 (表3)。基于临床信息，这些发现为单核细胞在PMOP中的作用提供了有价值的观点。

△表2：临床信息基本特征   

△表3：临床信息变量的Cox回归

根据应用的筛选标准，从绝经后正常人群和骨质疏松人群的PBMC中筛选出总共2302个基因，其中包括1301个上调基因和1001个下调基因（图1B）。同样，还过滤了来自蛋白质组数据的211种蛋白质，包括124种上调蛋白质和87种下调蛋白质（图4A）。随后，利用Upset图，我们在两个数据集中鉴定了16个共表达的PMOP相关基因，其中观察到10个基因表现出高表达，而6个基因表现出低表达（图4C）。值得注意的是，两个数据集的热图和箱线图描绘了相似的模式：观察到10个基因，即DMD、HSPB1、F7、NEB、AGL、PRNP、FABP3、CDH13、MBP和FBP2在骨质疏松组表达水平较高，正常组表达水平较高，而CYBB、SRPK1、SRGN、PACS1、RBPJ和BYSL6个基因在骨质疏松组表达水平较高，而正常组表达水平较低。图4D-G)。

△图 4 蛋白质组学和GEO数据集的差异分析

上述结果证明了单核细胞、16个PMOP相关基因与PMOP的潜在关联，因此有必要进一步探索其内在联系。16个基因对间的相关性表明，10个下调基因彼此正相关，与6个上调基因负相关（图5A，C）。GO和KEGG富集分析进一步表明，PMOP相关基因在趋化性相关途径中显著富集，与单核细胞的功能一致（图5B。免疫浸润分析还显示，单核细胞占据了PBMC样品的大部分，进一步证实了单核细胞与鉴定基因的关联（图5 D）。通过结合之前的结果，16个PMOP相关基因是PMOP中单核细胞功能的主要代表。有趣的是，如图5E所示，16个基因的热图与22个免疫细胞没有显著相关性，表明单核细胞在PMOP中的作用并不强烈依赖于其他具有相对独立性的免疫细胞。这些发现为单核细胞在PMOP中的作用提供了额外的证据，并表明这些基因可能是PMOP通过单核细胞发生和进展的潜在致病因素。  

△图 5 PMOP相关基因的功能与单核细胞有关

为了探究PMOP相关基因的潜在致病机制，对训练队列中的PMOP患者进行了共识聚类分析。将聚类变量 （K） 设置为 2 后，CDF 图显示了 0.1–0.9 共识指数谱中的最低范围，其中 delta 区域得分最高（图 6A、B）。此外，在K = 2时，共识矩阵图描绘了最大的均匀性（图6C）。因此，PMOP患者被分为两种亚型，即亚型1和亚型2。随后，通过主成分分析证实了两种亚型，结果显示出令人满意的分类结果（图6D）。热图和小提琴图证实，10个PMOP相关基因在亚型2中表达微弱，但在亚型1中表达突出，而其他6个PMOP相关基因在亚型1中微弱表达，在亚型2中明显表达（图6E，F）。因此，不同亚型的两组基因中不同的基因表达模式突出了它们在PMOP中的不同功能。

△图6：PMOP患者根据PMOP相关基因分为两种亚型

基于两种亚型之间的PMOP相关基因构建风险评分模型预测PMOP发生情况。该模型利用两个亚型来区分高BMD和低BMD组，表现出高水平的敏感性和特异性，准确度为0.85。混淆矩阵证实了这一点（图7A）。这强调了划分两种亚型基因表达模式的方法的有效性。基于上述预测混淆矩阵，将亚型10中高表达的1个基因指定为PMOP保护相关基因（PPGs），而亚型6中高表达的2个基因被指定为PMOP伤害相关基因（PHGs）。有趣的是，该结果与之前获得的差异分析结果相对应，其中PPG在两个数据集中均下调，而PHG在两个数据集中均上调。然后根据BMD高或低的绝经前和绝经后个体的PPG和PHGs计算GSVA评分。图 7B和C显示绝经前高BMD人群和低BMD人群的GSVA评分无显著差异，基于两类基因预测PMOP存在的AUC仅为0.575。相比之下，图7D显示绝经后PPG和PHG的GSVA评分不平衡。PPGs的GSVA评分在低BMD组低于高BMD组，而PHGs的GSVA评分在低BMD组高于高BMD组。ROC曲线显示出出色的预测效果，AUC为0.925（图7E）。此外，在健康人群中，GSVA评分表现出PPG绝经后评分增加和PHG绝经后评分下降的趋势，16个PMOP相关基因的总体GSVA评分上调（图7F）。此外，在骨质疏松人群中观察到相反的现象，因为PPGs减少，而PHG的风险评分显示差异增加，总体GSVA评分向上修正（图7G）。PPI分析的结果表明，绝经后PPG和PHG之间的相互作用效力显著增强，同时其作用方式的改变。综上所述，PPG和PHG的失调是PMOP患者的骨稳态失衡。   

△图7：PMOP保护相关基因（PPG）和PMOP伤害相关基因（PHGs）的不平衡导致了PMOP

为了更深入地研究影响PPGs和PHGs的调节机制，我们进行了基于GSVA的通路富集分析。我们观察到PPG和PHG分别在46条和24条信号通路中显著富集（表3、表4和表5）。在将两组的通路交叉后，我们确定了与PMOP保护和伤害相关的6种潜在信号通路（图8A）。此外，我们在图8B和C中描绘了高BMD和低BMD个体的GSVA评分在不同途径中的分布。具体来说，“肌萎缩侧索硬化症ALS”和“慢性粒细胞白血病”途径在高BMD和低BMD个体之间表现出差异。绝经前女性的BMD存在差异，而绝经后女性的“类固醇”、“Notch”和“慢性粒细胞白血病”途径则表现出差异。相关分析显示Notch通路与PPGs呈正相关，与PHGs呈负相关。相反，类固醇途径与PPG呈负相关，与PHG呈正相关（图8D）。基于这些发现，Notch和类固醇途径似乎联合作用，通过调节PPG和PHG来介导骨稳态失衡。

图8：富集分析确定了与PMOP保护基因(PPG)和PMOP危害基因(PHG)相关的通路

在之前的研究中，发现了一种介导PMOP进展的新机制。此外，为了评估健骨颗粒通过Notch和类固醇通路治疗PMOP的疗效，利用Vine plot获得了PMOP相关基因和健骨颗粒靶基因之间的10个重叠基因(图9A)。分析表明，这10个基因都参与了类固醇通路，包括“类固醇代谢过程”、“类固醇羟化酶活性”和“类固醇激素生物合成”(图9B和)。使用TCMSP数据库进行网络药理学分析，收集PMOP靶点，构建药物、成分、靶点和疾病之间的关系(图9D)。提示健骨颗粒中特定成分与Notch信号通路、类固醇信号通路有关。健骨颗粒中独特的成分可以纠正PPGs和PHGs的表达失衡，从而改善PMOP相关的骨稳态破坏。 

△图9：健骨颗粒可以恢复骨稳态失衡

END

这篇文章的内容可谓是相当丰富呀，在本研究中，作者整合了蛋白质组数据和GEO数据集，通过临床信息、蛋白质组学、转录组学、网络药理学以及动物实验等方法，低成本高效率地揭示了健骨颗粒治疗绝境后骨质疏松症的潜在机制。逻辑清晰，非常值得借鉴。这么好的思路完全可以冲击国自然课题作为后续研究基础。

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